Comment comparer des protéines ?
Comparer des protéines |
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Comparaison de protéines en fonction de la charge : électrophorèse.
Principe : L'électrophorèse est une migration dans un support poreux de molécules chargées électriquement en solution, dans un courant électrique. Dans ce cas le support n'agit pas comme facteur de séparation (support à mailles très lâches) et la taille des molécules importe peu.
On dépose le mélange de molécule dans le support puis on branche les électrodes. Les molécules chargées négativement (-) vont migrer vers la borne positive (+) et les molécules chargées positivement (+) vont migrer vers la borne négative (-).
Plus la molécule porte de charges (-), plus elle va migrer rapidement vers la borne (+).Plus la molécule porte de charges (-), plus elle va migrer rapidement vers la borne (+).
Toutes les molécules ne vont donc pas aller dans le même sens et pas à la même vitesse, en fonction des charges qu'elles portent. On a donc une séparation en fonction de la charge. Lorsque les charges sont différentes, la migration est différente.
des protéines de tailles différentes mais de charges identiques ne sont pas séparées par cette technique.
Réalisation pratique :
Utiliser un support poreux à mailles larges : papier, feuille d'acétate de cellulose, gel d'amidon, imbibé de solution saline conductrice, plonge à ses deux extrémités dans deux cuves de cette même solution, reliée l'une au pôle (+) et l'autre au pôle (-) du générateur.
Préparer des puits à mi-chemin du support et déposer chaque échantillon dans un puits.
Mettre sous tension pendant un temps déterminé (il faut arrêter la migration avant que les molécules n'atteignent l'extrêmité du support)
Révéler ensuite les protéines par un réactif coloré approprié.
Comparaison de protéines en fonction de la taille : électrophorèse.
Principe : L'électrophorèse est une migration dans un support poreux de molécules chargées électriquement en solution, dans un courant électrique. Dans ce cas toutes les molécules devront être chargées de la même manière (naturellement ou suite à un traitement). Le support agit comme tamis (support à mailles serrées). Plus les molécules sont petites, plus elles migrent rapidement donc plus elles seront allées loin lorsqu'on coupera le champ électrique.
Réalisation pratique :
Utiliser un support poreux à mailles serrées : gel de polyacrylamide, imbibé de solution saline conductrice, qui plonge à ses deux extrémités dans deux cuves de cette même solution, reliée l'une au pôle (+) et l'autre au pôle (-) du générateur.
Ajouter aux protéines du SDS ( Sodium dodécyl sulfate) qui va les dénaturer et les charger négativement : toutes les protéines sont déroulées et chargées négativement.
Préparer des puits du côté de la cathode (-) et déposer chaque échantillon dans un puits.
Mettre sous tension pendant un temps déterminé (il faut arrêter la migration avant que les molécules n'atteignent l'extrêmité du support)
Révéler ensuite les protéines par un réactif coloré approprié.
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